Trong quá trình chuyển giao plasmid F, relaxase TraI đóng vai trò then chốt. TraI cắt một sợi plasmid tại vị trí nic trong vùng khởi đầu chuyển giao (oriT), liên kết cộng hóa trị Tyr16 với phosphate 5′-ssDNA. TraI đảo ngược phản ứng cắt để khép vòng sợi plasmid, đòi hỏi nhóm 3′-hydroxyl. Bài viết này xác nhận TraI được vận chuyển đến tế bào nhận trong quá trình chuyển giao, theo dõi phản ứng cắt thứ cấp và cung cấp bằng chứng về việc sợi ssDNA F được chuyển giao với nhóm 3′-hydroxyl tự do.
Hình ảnh: Mô tả cấu trúc plasmid pACYC177 với các vùng oriT khác nhau của plasmid F, minh họa các biến thể và vị trí chèn gen kháng kháng sinh. Đây là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu chuyển giao plasmid và vai trò của oriT.
Vai trò của TraI trong chuyển giao plasmid F
Cơ chế hoạt động của TraI
TraI là một relaxase, tương tự như protein Rep trong cơ chế sao chép vòng lăn (rolling-circle replication – RCR). TraI cắt ssDNA thông qua transesterification, tạo liên kết phosphotyrosyl. TraI, giống như TrwC từ plasmid R388, chứa hai cặp Tyr liền kề (Y16, Y17; Y23, Y24). Y16 xúc tác phản ứng cắt ban đầu.
TraI và tính đặc hiệu của Tyr16
Nghiên cứu cho thấy chỉ Tyr16 là cần thiết cho chuyển giao plasmid F. Điều này khác với TrwC của R388, đòi hỏi hai Tyr hoạt động xúc tác. Các thí nghiệm với các biến thể TraI (Y16F, Y17F, Y23F, Y24F) cho thấy chỉ Y16F làm giảm đáng kể hiệu quả chuyển giao plasmid.
Hình ảnh: Sơ đồ thí nghiệm lai tạo hai bước để chứng minh sự chuyển giao plasmid và protein TraI giữa các chủng E. coli khác nhau, sử dụng các plasmid kháng kháng sinh khác nhau làm dấu chuẩn. Thí nghiệm này chứng minh rằng protein TraI được chuyển giao cùng với plasmid.
Vận chuyển TraI đến tế bào nhận
Bằng chứng cho thấy TraI được vận chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận. Thí nghiệm lai tạo hai bước chứng minh rằng TraI có thể hỗ trợ chuyển giao plasmid trong tế bào nhận, cho thấy TraI hoạt động sinh học và có khả năng xúc tác tất cả các phản ứng cần thiết cho chuyển giao plasmid.
Phản ứng cắt thứ cấp và vai trò của nó
Vị trí của phản ứng cắt thứ cấp
Nghiên cứu chỉ ra rằng phản ứng cắt thứ cấp xảy ra trong tế bào cho. Điều này được chứng minh bằng cách sử dụng tế bào nhận biểu hiện TraI, không làm tăng hiệu quả chuyển giao plasmid FΔTraI được bổ sung bởi TraI Y16F. Điều này cho thấy plasmid F được chuyển giao sang tế bào nhận dưới dạng ssDNA đã cắt với nhóm 3′-hydroxyl tự do.
TraI và khả năng nhận biết oriT ngắn
TraI có thể nhận biết và cắt các trình tự ssDNA oriT ngắn, cho thấy TraI quét ssDNA plasmid bằng cách chuyển vị. Thí nghiệm sử dụng plasmid pACYC177 với các vùng oriT khác nhau cho thấy TraI có thể chấm dứt chuyển giao tại oriT 35 bp, một trình tự ngắn chỉ chứa vị trí liên kết TraI.
Chuyển vị TraI trên ssDNA
Tốc độ chuyển vị của TraI
TraI là một helicase phụ thuộc ssDNA có khả năng phân tách DNA sợi đôi với tốc độ cao. TraI cũng có thể chuyển vị dọc theo ssDNA theo hướng 5′-3′ bằng cách thủy phân ATP. Các thí nghiệm đo hoạt tính ATPase phụ thuộc ssDNA của TraI cho thấy TraI chuyển vị nhanh chóng trên ssDNA.
Ảnh hưởng của trình tự nucleotide đến chuyển vị TraI
Hoạt tính ATPase của TraI chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi trình tự nucleotide của ssDNA. Trình tự nucleotide ở đầu 3′ của ssDNA có thể ảnh hưởng đến tốc độ phân ly của TraI, từ đó hạn chế hoạt tính ATPase của TraI.
Hình ảnh: Thí nghiệm về phản ứng nối oligonucleotide, so sánh hiệu quả nối của các trình tự khác nhau có và không có cấu trúc hairpin. Kết quả cho thấy cấu trúc hairpin hỗ trợ quá trình nối DNA.
Nhận biết đầu 3′ của plasmid F bị cắt bởi TraI
TraI có thể nhận biết đầu 3′ của plasmid F bị cắt tại nic. Các thí nghiệm ATPase cho thấy 3′oriT60-mer kích thích mạnh mẽ hoạt tính ATPase của TraI, trong khi 5′oriT60-mer chỉ kích thích yếu. Điều này cho thấy TraI phản ứng với đầu 3′ bằng cách làm chậm quá trình chuyển vị hoặc phân ly chậm.
Phản ứng liên kết TraI
Vai trò của cấu trúc hairpin
TraI xúc tác phản ứng liên kết oligonucleotide hiệu quả hơn khi có cấu trúc hairpin. Cấu trúc hairpin có thể cải thiện ái lực của TraI với oligonucleotide và làm thay đổi tương tác giữa ssDNA và TraI, chuyển dịch cân bằng về phía trạng thái liên kết.
Hình ảnh: Mô hình minh họa vai trò của TraI trong quá trình chuyển giao DNA plasmid F, với các bước khác nhau bao gồm khởi đầu, chuyển giao, tổng hợp sợi bổ sung và tái tổ hợp. Mô hình này cho thấy TraI có vai trò quan trọng trong cả tế bào cho và tế bào nhận.
Kết luận
Nghiên cứu này cung cấp thông tin chi tiết về cơ chế chuyển giao plasmid F do TraI xúc tác. TraI, một relaxase, đóng vai trò quan trọng trong việc cắt, chuyển giao và liên kết ssDNA. Trai K12 có khả năng nhận biết các trình tự oriT ngắn, chuyển vị trên ssDNA và xúc tác phản ứng liên kết với sự hỗ trợ của cấu trúc hairpin. Các kết quả này làm sáng tỏ quá trình chuyển giao plasmid và vai trò của TraI trong chuyển giao plasmid F.
