Khi bạn mới bắt đầu tìm hiểu về qPCR (phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực), có thể bạn sẽ gặp nhiều thuật ngữ chuyên môn, trong đó có “reporter”. Vậy Reporter Là Gì và nó đóng vai trò gì trong xét nghiệm qPCR? Bài viết này sẽ giải thích chi tiết về reporter và quencher, hai thành phần quan trọng trong thiết kế đầu dò (probe) cho qPCR.
1. Đầu Dò (Probe) Là Gì?
Đầu dò (Probe) là các đoạn trình tự DNA hoặc RNA ngắn, mạch đơn, có khả năng liên kết đặc hiệu với một trình tự đích trên DNA hoặc RNA. Có nhiều loại đầu dò khác nhau, bao gồm Taqman, molecular beacons, MGB Eclipse và hybridization. Trong đó, đầu dò Taqman được sử dụng rộng rãi nhất trong qPCR.
Đầu dò Taqman thường có cấu trúc cơ bản gồm hai thành phần chính:
- Reporter: Một phân tử phát huỳnh quang gắn ở đầu 5′.
- Quencher: Một phân tử hấp thụ huỳnh quang gắn ở đầu 3′.
Trong đó, reporter là phân tử quan trọng để phát hiện và định lượng trình tự đích. Hình ảnh trên minh họa cấu trúc cơ bản của đầu dò Taqman và hiệu ứng FRET, cho thấy mối quan hệ giữa reporter và quencher.
Khi đầu dò Taqman còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tín hiệu huỳnh quang phát ra từ reporter thông qua hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET). Về lý thuyết, quencher sẽ hấp thụ hoàn toàn tín hiệu, nhưng trong thực tế, hiệu quả hấp thụ không đạt 100%. Mức độ hấp thụ phụ thuộc vào khoảng cách vật lý giữa reporter và quencher, cũng như sự tương thích giữa bước sóng của chúng.
2. Nguyên Lý Hoạt Động Của Đầu Dò Taqman Trong qPCR
Trong qPCR, đầu dò Taqman được sử dụng để khuếch đại và phát hiện DNA của tác nhân mục tiêu. Cơ chế hoạt động diễn ra như sau:
- Đầu dò Taqman liên kết với trình tự mục tiêu nằm giữa hai primer (mồi).
- Enzyme Taq polymerase kéo dài primer để tổng hợp sợi mới.
- Khi Taq polymerase gặp đầu dò Taqman, nó sẽ thể hiện hoạt tính exonuclease và cắt bỏ đầu dò.
- Reporter được giải phóng, tách khỏi quencher và phát tín hiệu huỳnh quang khi được kích thích bằng ánh sáng.
- Máy real-time PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang này. Lượng DNA được khuếch đại càng nhiều, tín hiệu huỳnh quang càng mạnh.
Hình ảnh trên mô tả chi tiết cách đầu dò Taqman hoạt động trong quá trình qPCR, từ liên kết với trình tự đích đến khi reporter phát tín hiệu.
3. Cách Chọn Reporter Và Quencher Phù Hợp
3.1. Chọn Reporter
3.1.1. Khả Năng Tương Thích Của Thiết Bị
Reporter là phân tử phát huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích (Absorption max) phù hợp. Mỗi reporter có một bước sóng kích thích và bước sóng phát huỳnh quang (Emission max) riêng. Do đó, khi chọn reporter, cần đảm bảo thiết bị qPCR có khả năng phát ra ánh sáng kích thích tương thích với reporter đó.
Hình ảnh trên cung cấp thông tin chi tiết về bước sóng kích thích và phát xạ của các reporter phổ biến, giúp bạn lựa chọn reporter phù hợp với thiết bị qPCR của mình.
3.1.2. Chọn Reporter Cho Phản Ứng qPCR Multiplex
Trong phản ứng multiplex qPCR, mỗi trình tự mục tiêu cần được xác định bằng một reporter riêng. Để tránh nhiễu tín hiệu, nên chọn các reporter có bước sóng kích thích và phát huỳnh quang cách xa nhau.
Ví dụ, khi multiplex hai tác nhân mục tiêu, nên chọn FAM và HEX thay vì FAM và TET. Ngoài ra, nên sử dụng reporter có tín hiệu mạnh như FAM cho các tác nhân có nồng độ thấp và reporter có tín hiệu yếu hơn cho các tác nhân có nồng độ cao.
3.2. Chọn Quencher
Quencher là phân tử hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. Việc chọn quencher cần dựa trên sự tương thích giữa khoảng bước sóng hấp thụ của quencher và bước sóng phát huỳnh quang của reporter.
Ví dụ, quencher BHQ1 hấp thụ huỳnh quang trong khoảng 480-580 nm sẽ hấp thụ tín hiệu huỳnh quang của FAM và HEX tốt hơn so với BHQ2 hoặc BHQ3.
Hình ảnh trên minh họa cách chọn quencher phù hợp với từng loại reporter, giúp tối ưu hóa hiệu quả dập tắt tín hiệu và tăng độ chính xác của xét nghiệm.
Quencher có thể được chia thành hai loại:
- Quencher phát huỳnh quang: Chuyển năng lượng hấp thụ được thành ánh sáng. Ví dụ: TAMRA.
- Quencher phát nhiệt: Chuyển năng lượng hấp thụ được thành nhiệt. Ví dụ: DABCYL, BHQ, IBFQ. Quencher phát nhiệt được sử dụng phổ biến hơn trong các phản ứng multiplex qPCR để tránh nhiễu chéo giữa các kênh màu. Trong đó, quencher BHQ được sử dụng rộng rãi nhất.
Hy vọng bài viết này đã giúp bạn hiểu rõ hơn về reporter là gì và cách chọn reporter và quencher phù hợp cho xét nghiệm qPCR của mình. Việc lựa chọn đúng các thành phần này sẽ góp phần quan trọng vào độ chính xác và tin cậy của kết quả xét nghiệm.
