Chuyển gen thành công đòi hỏi phương pháp chuyển an toàn và hiệu quả. Bài viết này tập trung vào việc sử dụng một polymer cation, được tổng hợp bằng cách liên kết chéo poly(ethylenimine) (PEI) phân nhánh trọng lượng phân tử thấp (LMW) với β-cyclodextrin và propane 1,2,3-triol, để chuyển gen không virus một cách hiệu quả và an toàn.
Thí nghiệm cho thấy polymer này có khả năng đệm pH và khả năng ngưng tụ DNA tương đương với PEI 25 kDa. Trong tế bào B16-F0, polymer này làm tăng hiệu quả chuyển gen của DNA trần lên 700 lần và mang lại hiệu quả chuyển gen tốt hơn Fugene HD (cao hơn ba lần) và PEI 25 kDa (cao hơn năm lần). Hiệu quả chuyển gen cao của polymer không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của huyết thanh trong quá trình chuyển gen. Bên cạnh tế bào B16-F0, polymer này cho phép chuyển gen hiệu quả các tế bào HepG2 và U87 với độc tính thấp. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng polymer này là một thuốc thử chuyển gen an toàn và hiệu quả, đảm bảo phát triển hơn nữa cho các ứng dụng in vitro, in vivo và lâm sàng.
Giới Thiệu
Chuyển gen bằng vector virus và không virus là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng do các ứng dụng tiềm năng trong liệu pháp gen. Mặc dù vector virus thường có hiệu quả chuyển gen cao hơn, nhưng tính sinh miễn dịch và rủi ro an toàn khiến chúng trở thành một lựa chọn không phù hợp cho các ứng dụng lâm sàng. Trong những năm qua, nhiều hệ thống chuyển gen không virus đã được báo cáo. Trong số các hệ thống này, poly(ethylenimine) (PEI) đã thu hút được sự chú ý đặc biệt vì hiệu quả chuyển gen cao. PEI là một polyamine có khả năng đệm proton cao trong một phạm vi pH rộng. So với đối tác tuyến tính của nó, PEI phân nhánh (bPEI) có hàm lượng amine bậc một cao hơn. Vì amine bậc một thường phản ứng mạnh hơn amine bậc hai, bPEI dễ dàng được sửa đổi hơn và do đó được ưa chuộng hơn PEI tuyến tính trong nghiên cứu chuyển gen.
Thực tế, ngay từ những năm 1990, bPEI 25 kDa đã được khai thác như một chất mang gen. Polymer này và các dẫn xuất của nó cũng nổi lên như những ứng cử viên hàng đầu để cung cấp các vật liệu nucleic khác nhau (chẳng hạn như ribozyme, plasmid và oligonucleotide) cho các nghiên cứu trên động vật. Mặc dù bPEI 25 kDa thể hiện hiệu quả chuyển gen cao, nhưng độc tính của nó cũng cao. Quan sát sau này được hỗ trợ bởi tỷ lệ tử vong 8,6% ở chuột 24 giờ sau khi nhỏ mũi bPEI 25 kDa. Độc tính cao như vậy đã cản trở ứng dụng thực tế của bPEI 25 kDa.
Để giảm độc tính, bPEI trọng lượng phân tử thấp (LMW) đã được khai thác như một chất mang gen thay thế. Mặc dù LMW bPEI thể hiện độc tính thấp hơn, nhưng hiệu quả chuyển gen của nó thấp hơn rõ rệt so với hiệu quả thu được với bPEI trọng lượng phân tử cao. Kết quả này đã được chứng minh bởi một nghiên cứu trước đó, nghiên cứu này phát hiện ra rằng trong tế bào EA.hy 926 có nguồn gốc từ tế bào nội mô người, PEI có trọng lượng phân tử 70 kDa mang lại hiệu quả chuyển gen trung bình khoảng 20–30%, trong khi PEI có trọng lượng phân tử nhỏ hơn hoặc bằng 1,8 kDa tạo ra ít hoặc không có chuyển gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã liên kết LMW bPEI trước tiên với propane 1,2,3-triol, đóng vai trò là một liên kết phân hủy sinh học tạo ra một cấu trúc trọng lượng phân tử cao hơn, có khả năng phân hủy sinh học của PEI. Sản phẩm sau đó được liên kết chéo với β-cyclodextrin (β-CD) để tạo thành một nanopolymer với kiến trúc hình sao. Nanopolymer đó được chỉ định là β-CD-bPEI-propane 1,2,3-triol (BPEA). Hiệu quả chuyển gen của BPEA không chỉ tương đương, hoặc thậm chí vượt trội, so với hiệu quả thu được khi sử dụng bPEI 25 kDa hoặc Fugene HD trong các dòng tế bào khối u khác nhau, mà còn tạo ra ít hoặc không có độc tính. Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng BPEA là một nanopolymer mới đảm bảo phát triển hơn nữa như một chất mang gen cho cả chuyển gen in vitro và in vivo.
Vật Liệu và Phương Pháp
Vật Liệu
Hóa Chất
bPEI (Mw = 1,2 và 25 kDa), β-cyclodextrin, dimethyl sulfoxide (DMSO), triethylamine (Et3N), propane 1,2,3-triol, và 1,1′-carbonyldiimidazole (CDI) được mua từ Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). bPEI 25 kDa được tinh chế bằng cách thẩm tách chống lại nước cất ba lần, sau đó đông khô trước khi sử dụng.
Plasmid
Plasmid pEGFP-N1 và vector báo cáo pGL3 Luciferase được mua từ BD Biosciences (San Jose, CA) và Promega Corporation (Madison, WI), tương ứng. Chúng được biến nạp vào tế bào DH5α có khả năng và được trải lên đĩa LB có bổ sung ampicillin 100 µg/mL. Sau đó, plasmid được phân lập bằng cách sử dụng bộ PureLink Hipure Plasmid Maxiprep kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng và số lượng của plasmid đã được tinh chế được phân tích bằng cách đo mật độ quang của chúng ở 260 và 280 nm.
Nuôi Cấy Tế Bào
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Minimum Essential Medium (MEM), trypsin–EDTA (0,25% trypsin–EDTA), penicillin–streptomycin (10.000 đơn vị penicillin và 10 mg streptomycin/ml) và fetal bovine serum (FBS) được lấy từ Invitrogen. Tế bào U87 glioblastoma người, tế bào B16 melanoma chuột và tế bào HepG2 ung thư biểu mô tế bào gan người được mua từ ATCC (American Type Culture Collection).
Động Vật
Chuột C57/BL6 cái bình thường được mua từ Trung tâm Nghiên cứu Động vật Thí nghiệm Daehan (Hàn Quốc). Tất cả các công việc liên quan đến động vật đều được tiến hành theo giao thức được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Trung tâm Y tế Yonsei, Seoul, Hàn Quốc.
Phương Pháp
Tổng Hợp BPEA
Propane 1,2,3-triol được hòa tan trong DMSO đã khử khí ở nồng độ 0,17 g/ml và trộn với dung dịch DMSO (0,3 g/ml) của CDI. Et3N được thêm vào hỗn hợp phản ứng ở nồng độ 33 µl/ml. Phản ứng được thực hiện trong bóng tối trong 3 giờ dưới bầu khí quyển nitơ trơ. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được pha loãng với 5 ml DMSO đã khử khí, tiếp theo là bổ sung dung dịch DMSO (0,88 g/ml) của bPEI 1,2 kDa. Phản ứng được thực hiện trong 16 giờ trong bóng tối ở 37°C dưới bầu khí quyển nitơ trơ. Hỗn hợp phản ứng thô được thẩm tách chống lại nước cất ba lần ở 4°C trong 3 ngày với giới hạn trọng lượng phân tử là 2 kDa. Sau đó, dung dịch được lọc bằng cách sử dụng bộ lọc syringe và đông khô trong 2 ngày để thu được bPEI-propane 1,2,3-triol (PEA).
Để tổng hợp BPEA, β-CD và CDI trước tiên được trộn với tỷ lệ 1∶1. Sau đó, hỗn hợp được hòa tan trong DMSO đã khử khí ở nồng độ 0,2 g/ml. Et3N được thêm vào hỗn hợp phản ứng ở nồng độ 33 µl/ml. Phản ứng được thực hiện trong 3 giờ trong bóng tối dưới bầu khí quyển nitơ trơ. Sau đó, 14 ml dung dịch PEA trong DMSO được thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng. Phản ứng được thực hiện trong 16 giờ và được thực hiện trong bóng tối ở 37°C dưới bầu khí quyển nitơ trơ. Hỗn hợp phản ứng thô được thẩm tách chống lại nước cất ba lần ở 4°C trong 3 ngày với giới hạn trọng lượng phân tử là 12,4 kDa. Sau đó, dung dịch được lọc bằng bộ lọc syringe. BPEA thu được sau khi đông khô trong 2 ngày.
Cộng Hưởng Từ Hạt Nhân Proton (1H-NMR)
20 mg BPEA, PEA hoặc PEI được hòa tan trong 0,7 ml deuterium oxide (D2O). Phổ 1H-NMR được ghi lại trên máy quang phổ NMR (500 MHz; Bruker Corporation, Đức).
Quang Phổ Hồng Ngoại Biến Đổi Fourier (FT-IR)
Quang phổ FT-IR được thực hiện bằng máy quang phổ FT-IR (Spectrum 2000, PERKIN ELMER) trong điều kiện môi trường xung quanh. Kỹ thuật đĩa kali bromide (KBr) được sử dụng để phân tích. Phổ được thu ở độ phân giải 2 cm−1 và được báo cáo là trung bình của 16 lần quét.
Phân tích khối phổ thời gian bay ion hóa laser hỗ trợ bằng matrix (MALDI-TOF). Dung dịch matrix được chuẩn bị bằng cách hòa tan 10 mg matrix (2,5-dihydroxybenzoic acid/fucose = 1∶1) trong 1 ml hỗn hợp nước/acetonitrile 1∶1. Dung dịch này sau đó được trộn với dung dịch nước của mẫu (0,5 mg/ml) theo tỷ lệ 1∶1 trước khi phân tích. Phân tích khối phổ MALDI-TOF được thực hiện bằng máy đo khối phổ Voyager Biospectrometry Workstation (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), được trang bị laser N2 xung (λ = 337 nm, chiều rộng xung 2 ns) và hoạt động ở chế độ chiết tuyến tính có độ trễ. Điện áp gia tốc được sử dụng là 22 kV.
Hình Thành Polyplex và Kính Hiển Vi Điện Tử
Polyplexes BPEA/DNA được điều chế bằng cách thêm dung dịch polymer (trong nước cất ba lần) vào một thể tích tương đương dung dịch plasmid (trong đệm Tris/EDTA) theo tỷ lệ khối lượng trên khối lượng BPEA/DNA thích hợp. Hỗn hợp được khuấy nhẹ trong 10 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Hình thái bề mặt của polyplexes BPEA/DNA được mô tả bằng cả kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Tóm lại, mười microliter dung dịch polyplex được làm khô trên giá đỡ đồng mẫu Joel. Các polyplex được chụp ảnh trên LaB6 Joel CX120 II với phần đính kèm quét ASID ở 20 kV. Bên cạnh đó, một giọt dung dịch polyplex chứa 0,1% wt phosphotungstic acid (PTA) được đặt trên lưới đồng phủ carbon 200 mesh. Sau khi dung môi bay hơi trong điều kiện môi trường xung quanh trong 5 phút, hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM-2010 TEM) hoạt động ở điện áp gia tốc 100 kV.
Đo Kích Thước Hạt và Điện Thế Zeta
Kích thước và điện tích bề mặt của các polyplex được hình thành được kiểm tra bằng tán xạ ánh sáng laser (Zetasizer 3000, Malvern Instruments, Vương quốc Anh). Dữ liệu được báo cáo là trung bình của 10 lần đo.
Thử Nghiệm Làm Chậm Gel
Khả năng ngưng tụ pDNA của polymer được quan tâm được nghiên cứu bằng thử nghiệm làm chậm gel. Sau khi hình thành polyplexes, các polyplex được trộn với đệm tải, nhuộm bằng Loading STAR (DYNE Bio, Seongnam, Hàn Quốc) và điện di trong gel agarose 1% ở 80 V trong một giờ.
Thử Nghiệm Khả Năng Đệm pH
Khả năng đệm pH của BPEA và bPEI 25 kDa được đánh giá như mô tả trước đây.
Thử Nghiệm Hiệu Quả Chuyển Gen In Vitro
Các dòng tế bào ung thư khác nhau (U87, B16 và HepG2) được gieo riêng biệt trong đĩa 24 giếng với mật độ 1×105 tế bào trên mỗi giếng và được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Trong quá trình chuyển gen, môi trường tăng trưởng được thay thế bằng 300 µl môi trường tươi có hoặc không có 10% FBS. Việc điều chế polyplexes của BPEA/pGL3 hoặc BPEA/pEGFP-N1 được thực hiện bằng cách trộn 2 µg plasmid với một lượng BPEA thích hợp theo tỷ lệ khối lượng trên khối lượng BPEA/DNA thích hợp. Hỗn hợp được khuấy nhẹ trong 10 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, nước cất ba lần được thêm vào hỗn hợp theo thể tích để đạt được thể tích cuối cùng là 100 µl. Hỗn hợp được thêm vào mỗi giếng. Sau khi ủ trong 5 giờ ở 37°C, môi trường chuyển gen được thay thế bằng môi trường tăng trưởng tươi. Các tế bào được ủ ở 37°C trong 24 giờ bổ sung.
Trong quá trình thí nghiệm, Fugene HD và bPEI 25 kDa được sử dụng làm đối chứng dương. Hiệu quả chuyển gen của BPEA được xác định bằng thử nghiệm hoạt động luciferase như mô tả trước đây. Đánh giá hiển vi biểu hiện EGFP trong các tế bào được chuyển gen cũng được thực hiện theo phương pháp đã được công bố trước đó. Để thực hiện phân tích tế bào dòng chảy, các tế bào được chuyển gen được trypsin hóa và tái huyền phù trong PBS. Sắp xếp tế bào hoạt hóa huỳnh quang (FACS) của các tế bào dương tính với EGFP được thực hiện bằng cách sử dụng máy đo tế bào dòng chảy (Epics XL; Coulter, Hialeah, FL). Các tế bào không được chuyển gen được sử dụng để thiết lập nền.
Thử Nghiệm Độc Tính Tế Bào
Các dòng tế bào ung thư khác nhau (U87, B16 và HepG2) được gieo riêng biệt trong đĩa 96 giếng với mật độ ban đầu là 5.000 tế bào trên mỗi giếng và được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Môi trường tăng trưởng được thay thế bằng 100 µl môi trường nuôi cấy tế bào tươi có hoặc không có 10% FBS. 10 µl dung dịch polymer được thêm vào mỗi giếng. Sau khi ủ trong 5 giờ ở 37°C, môi trường chứa polymer được thay thế bằng 100 µl môi trường tăng trưởng tươi. Độc tính tế bào của polymer được đánh giá bằng cách sử dụng Cell Count Kit-8 (CCK-8) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khả năng sống sót của tế bào (%) trong mỗi giếng được xác định bằng cách chia giá trị độ hấp thụ (A450) của giếng thử nghiệm cho giá trị A450 của giếng đối chứng, sau đó nhân thương số với 100.
Thu Thập Máu và Thử Nghiệm Tan Máu
Máu từ chuột được gây mê thông qua chọc tim được thu thập vào ống chứa heparin và ly tâm trong 10 phút ở 2.000 g ở 4°C. Các tế bào hồng cầu được thu thập được rửa bằng PBS (pH = 7,4) cho đến khi dịch nổi có màu trong. Polyplexes của BPEA và PEI 25 kDa, ở các tỷ lệ polymer/DNA khác nhau, được điều chế mới trong PBS trước khi sử dụng. Các tế bào hồng cầu được thu thập được thêm vào để đạt được nồng độ cuối cùng là 8% (v/v). Sau khi ủ ở 37°C trong một giờ, hỗn hợp được ly tâm ở 2.000 g trong 15 phút. Độ hấp thụ của dịch nổi được ghi lại ở 414 nm. Các thí nghiệm được thực hiện ba lần. Mức độ tan máu trong PBS và Triton X-100 0,1% được xác định là 0% và 100%, tương ứng.
Kết Quả
Điều Chế và Mô Tả Đặc Tính BPEA
Tổng Hợp PEA và BPEA
Quy trình tổng hợp BPEA được thể hiện trong Hình 1. Quy trình tổng hợp bao gồm hai giai đoạn. Trong giai đoạn đầu tiên, các nhóm hydroxyl của propane 1,2,3-triol được kích hoạt bởi CDI. Các chất trung gian imidazolyl carbamate hoạt động được hình thành và sau đó bị tấn công bởi các nhóm amine bậc một của PEI để tạo ra PEA. Trong giai đoạn thứ hai, CDI kích hoạt các nhóm hydroxyl của β-CyD, đến lượt nó phản ứng với các nhóm amine bậc một của PEA để tạo ra BPEA. Vì giới hạn trọng lượng phân tử (12,4 kDa) của màng thẩm tách được sử dụng để phân lập BPEA cao hơn nhiều so với trọng lượng phân tử của tất cả các chất phản ứng được sử dụng trong suốt các thí nghiệm, quy trình thẩm tách mang lại sản phẩm có độ tinh khiết cao.
Nghiên Cứu NMR và FT-IR
Theo Hình 2, các tín hiệu đại diện của PEI (proton -CH2CH2N-) trong D2O cộng hưởng giữa 2,5 và 3,2 ppm (Hình 2A). Sự hiện diện của các đỉnh, cộng hưởng giữa 3,7 ppm và 4,1 ppm, từ propane 1,2,3-triol (CH, CH2) chứng minh sự tạo thành thành công của PEA (Hình 2B). Phổ NMR của BPEA được thể hiện trong Hình 2C. Sự hiện diện của tín hiệu đại diện ở 4,95 ppm (hydro C-1 trong β-CyD) trong phổ của BPEA cho thấy sự kết hợp thành công của β-CyD vào PEA. Tỷ lệ mol của PEI trên β-CyD trên propane 1,2,3-triol trong BPEA được tính toán dựa trên các giá trị tích phân proton của phổ 1H NMR: 2,3–2,8 ppm (CH2 của PEI), 4,95 ppm (hydro C-1 trong β-CyD) và 3,7–4,1 ppm (CH và CH2 từ propane 1,2,3-triol) và được xấp xỉ là 5∶1∶6.
Sự tạo thành thành công của PEA và BPEA được xác nhận thêm bằng cách sử dụng FT-IR. Trong phổ của PEI (Hình 3A), các đỉnh rung kéo dài của proton được gán cho methyl và methylene có thể được tìm thấy ở 2920 cm−1 và 2822 cm−1. Sau khi liên kết chéo PEI với propane 1,2,3-triol và do liên kết hydro giữa N-H của PEI và C = O của propane 1,2,3-triol, tín hiệu ester đã chuyển sang 1703 cm−1 trong phổ của PEA (Hình 3B). Cuối cùng, ngoài đỉnh rộng do nhóm OH gây ra ở khoảng 3200–3400 cm−1, các đỉnh rung kéo dài O-C của β-CD xuất hiện ở 1032, 1083 và 1153 cm−1 trong phổ của BPEA (Hình 3C), cho thấy sự kết hợp thành công của β-CD vào PEA.
MALDI-TOF
BPEA và PEA được mô tả đặc tính thêm bằng cách sử dụng MALDI-TOF. Các tín hiệu cường độ cho PEA được tìm thấy rộng rãi trong phạm vi từ 499,0 đến 8253,6 (m/z), với các đỉnh cao nhất được tìm thấy ở khoảng 706,9 (m/z) (Hình 4A). Mặt khác, hầu hết các tín hiệu cường độ trong phổ của BPEA xuất hiện từ 513,6 đến 19873,9 (m/z), với các đỉnh cao nhất được tìm thấy ở 1137,4 (m/z) (Hình 4B). Do tính đa phân tán cao của các polymer của chúng tôi và sự phân biệt khối lượng kết quả chống lại các oligomer khối lượng cao trong phổ MALDI-TOF, việc phân bố trọng lượng phân tử (MWD) của PEA và BPEA khó có thể được xác định chính xác bằng cách sử dụng các kết quả. Tuy nhiên, so với vị trí của các đỉnh trong phổ của PEA, các đỉnh trong phổ của BPEA đã được chuyển sang phạm vi khối lượng cao hơn. Sự chuyển dịch như vậy chỉ ra rằng khối lượng phân tử của BPEA cao hơn PEA, cho thấy liên kết chéo thành công của PEA bằng β-CyD.
Mô Tả Đặc Tính Vật Lý Của BPEA
Một sơ đồ biểu diễn quá trình hình thành polyplex giữa BPEA và plasmid DNA được minh họa trong Hình 5A. Người ta kỳ vọng rằng các polyplex được hình thành chủ yếu thông qua các tương tác tĩnh điện. Như được hiển thị bởi SEM, hình thái của polyplexes BPEA/DNA là các hình cầu nhỏ gọn (Hình 5B). Kích thước hạt của polyplexes BPEA được hình thành ở tỷ lệ polymer/DNA tối ưu (60/1) được ước tính bằng TEM là 283,3±40,8 nm (Hình 5C), với sự phân bố kích thước đơn phương thức từ 240 đến 320 nm. Điều này phù hợp với kích thước hạt được xác định bằng tán xạ ánh sáng động (DLS), phương pháp này phát hiện ra rằng ở tỷ lệ polymer/DNA là 60/1, polyplexes BPEA/DNA có kích thước hạt nhỏ nhất và có đường kính trung bình Z khoảng 270–330 nm (Hình 6A).
Ngoài ra, điện thế zeta của polyplexes BPEA là dương ở tất cả các tỷ lệ N/P được thử nghiệm (Hình 6B). Kết quả của thử nghiệm làm chậm gel cho thấy rằng BPEA có thể làm chậm hoàn toàn DNA ở tỷ lệ polymer/DNA là 0,25/1 và khả năng ngưng tụ DNA như vậy có thể so sánh với PEI 25 kDa (Hình 6C). Như được xác định bằng chuẩn độ acid-base, khả năng đệm pH của BPEA có thể so sánh với bPEA 25 kDa (Hình 6D).
Chuyển Gen In Vitro
Đánh giá hiển vi biểu hiện EGFP. Hình ảnh huỳnh quang và hình ảnh tương phản giao thoa khác biệt của các tế bào B16-F0 được chuyển gen bằng BPEA ở các tỷ lệ polymer/DNA khác nhau được thể hiện trong Hình 7A. Huỳnh quang EGFP thu được từ chuyển gen qua trung gian BPEA được đánh giá định lượng bằng tế bào dòng chảy (Hình 7B). Hiệu quả chuyển gen cao nhất thu được bởi BPEA cao hơn 3 lần và 5 lần so với hiệu quả đạt được bởi Fugene HD và PEI 25 kDa, tương ứng (Hình 7Ba). So với việc chỉ sử dụng DNA, BPEA có thể làm tăng hiệu quả chuyển gen lên đến 700 lần (Hình 7Ba). Hiệu quả chuyển gen cao như vậy được duy trì ngay cả khi có 10% FBS (Hình 7Bb). Bên cạnh các tế bào B16-F0, hiệu quả chuyển gen cao của BPEA đã được xác nhận trong các tế bào HepG2 và U87. Kết quả tế bào dòng chảy cho thấy rằng hiệu quả chuyển gen cao nhất đạt được bởi BPEA trong hai dòng tế bào này có thể so sánh với Fugene HD và PEI 25 kDa, vượt trội hơn nhiều so với plasmid trần (Hình 7Bc–f).
Thử Nghiệm Hoạt Động Luciferase
Ngoài thử nghiệm hiệu quả chuyển gen EGFP, hiệu quả chuyển gen của BPEA đã được đánh giá bằng thử nghiệm hoạt động luciferase (Hình 8). Kết quả cho thấy rằng các tế bào B16-F0 được chuyển gen bằng BPEA có hoạt động luciferase cao hơn 1–2 bậc so với các tế bào được chuyển gen bằng Fugene HD và PEI 25 kDa và cao hơn 4–5 bậc so với các tế bào được chuyển gen bằng DNA đơn thuần. Trong các tế bào HepG2 và U87, hoạt động luciferase của các tế bào được chuyển gen bằng BPEA cũng gần với hoạt động của các tế bào được chuyển gen bằng Fugene HD và PEI 25 kDa. Hiệu quả chuyển gen cao của BPEA không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của huyết thanh trong quá trình chuyển gen.
Độc Tính Tế Bào và Tan Máu
Độc tính tế bào của BPEA trong các tế bào B16-F0, HepG2 và U87 khi không có và có 10% FBS được thể hiện trong Hình 9. Kết quả cho thấy rằng, lên đến nồng độ 200 µg/ml, BPEA về cơ bản không độc đối với tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm. So sánh, các tế bào được xử lý bằng PEI 25 kDa cho thấy sự giảm mạnh về khả năng sống sót của chúng khi nồng độ polymer tăng lên. Kết quả của thử nghiệm tan máu của chúng tôi (Hình 10) cũng cho thấy rằng PEI 25 kDa gây ra khoảng 60–80% tan máu, cao hơn khoảng 2–4 lần so với mức độ giải phóng hemoglobin do BPEA gây ra.
Thảo Luận
Trong những năm qua, PEI đã được khai thác rộng rãi như một vector ứng cử viên để chuyển gen do hiệu quả chuyển gen cao; tuy nhiên, tính thực tế lâm sàng của nó đã bị cản trở bởi độc tính cao trong quá trình chuyển gen. Một nghiên cứu trước đó đã so sánh hiệu quả chuyển gen của PEI với các trọng lượng phân tử khác nhau (600, 1200, 1800, 10.000 và 70.000 Da) trong tế bào nội mô. Nghiên cứu này phát hiện ra rằng hiệu quả chuyển gen của PEI tương quan dương với trọng lượng phân tử của PEI và PEI có trọng lượng phân tử dưới 1.800 Da về cơ bản không chuyển gen được tế bào. Dựa trên thực tế này, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã liên kết chéo LMW PEI với propane 1,2,3-triol thông qua các phản ứng ghép nối qua trung gian CDI (Hình 1) để tạo ra một cấu trúc trọng lượng phân tử cao hơn, có khả năng phân hủy sinh học của PEI, cụ thể là PEA. Sự gia tăng trọng lượng phân tử sau khi liên kết chéo được kỳ vọng sẽ làm tăng hiệu quả chuyển gen của LMW PEI ban đầu không liên kết chéo. Nhưng do khả năng phân hủy sinh học cao của propane 1,2,3-triol, tác động của việc tăng trọng lượng phân tử đối với độc tính là tối thiểu.
Để tăng cường hơn nữa hiệu quả trong chuyển gen, PEA đã được liên kết chéo với β-cyclodextrin (β-CD) để tạo ra một nanopolymer với kiến trúc hình sao. Khả năng sử dụng cyclodextrin làm chất liên kết để cải thiện hiệu suất của chất mang gen đã được đề xuất bởi một nghiên cứu trước đó, nghiên cứu này đã liên kết PEI với β-cyclodextrin và quan sát thấy rằng sản phẩm thu được đã gây ra sự gia tăng biểu hiện luciferase khoảng bốn lần so với biểu hiện do PEI không sửa đổi gây ra. Gần đây hơn, một loạt các polymer hình sao đã được báo cáo bởi Yang et al., người đã liên hợp nhiều nhánh oligoethylenimine lên lõi α-cyclodextrin. Các polymer hình sao cho thấy hiệu quả chuyển gen cao trong các tế bào HEK293 và Cos7 và có độc tính thấp hơn nhiều so với bPEI 25 kDa. Vì những tiến bộ hiện tại trong các ứng dụng của cyclodextrin đối với chuyển gen không virus đã được xem xét bởi một bài báo gần đây, người đọc được giới thiệu đến bài báo đó để biết chi tiết. Nói chung, cyclodextrin có tiềm năng cao trong chuyển gen vì ái lực liên kết của chúng với acid nucleic, khả năng làm giảm độc tính tế bào của các vector gen khác và khả năng tăng cường hấp thụ của chúng trong phân phối điều trị. Dựa trên thực tế này, hiệu suất của PEA trong chuyển gen dự kiến sẽ được tăng cường khi liên kết chéo với β-CD.
Cấu trúc của BPEA được mô tả đặc tính bằng NMR. Sự hiện diện của các đỉnh cộng hưởng giữa 3,7 ppm và 4,1 ppm từ propane 1,2,3-triol (CH, CH2), 2,5 và 3,2 ppm từ PEI (proton -CH2CH2N-) và tín hiệu đại diện ở 4,95 ppm từ β-CD (hydro C-1) chứng minh sự tạo thành thành công của BPEA (Hình 2). Sự thành công của quá trình hình thành BPEA được xác nhận thêm bởi sự hiện diện của ba nhóm tín hiệu sau trong phổ FT-IR của BPEA (Hình 3): (a) tín hiệu ester ở khoảng 1700 cm-1, (b) các đỉnh rung kéo dài O-C của β-CD ở khoảng 1030–1150 cm−1 và (c) các đỉnh rung kéo dài của proton methyl và methyne trong PEI ở khoảng 2820–2920 cm−1. Hơn nữa, như được hiển thị bởi phổ khối MALDI-TOF của PEA và BPEA, các đỉnh trong phổ của BPEA đã được chuyển sang phạm vi khối lượng cao hơn so với các đỉnh trong phổ của PEA (Hình 4). Sự chuyển dịch như vậy chỉ ra rằng khối lượng phân tử của BPEA cao hơn PEA, cho thấy sự liên kết chéo thành công của PEA bằng β-CyD.
Độc tính tế bào của BPEA được xác định bằng thử nghiệm độc tính tế bào của chúng tôi, thử nghiệm này tiết lộ rằng trong tất cả các dòng tế bào được thử nghiệm (tức là U87, HepG2 và B16-F0), BPEA có độc tính tế bào thấp trong một phạm vi nồng độ rộng (Hình 9). Độc tính tế bào thấp của BPEA có thể là do mật độ điện tích thấp của các polyplex của nó. Như được đề xuất bởi một nghiên cứu trước đó, độc tính tế bào của PEI 25 kDa một phần là do đặc tính phá vỡ màng của các polymer cation dày đặc. Hiệu ứng này được hỗ trợ bởi quan sát rằng ở tỷ lệ N/P là 10 trở lên, điện thế zeta của các polyplex được hình thành bởi PEI 25 kDa thường cao hơn +30 mV. Tuy nhiên, điện thế zeta của các polyplex được hình thành bởi BPEA nhỏ hơn +20 mV ở tất cả các tỷ lệ được thử nghiệm (Hình 6). Mật độ điện tích thấp như vậy của các polyplex BPEA có thể giải thích cho sự phá vỡ màng tế bào giảm và do đó độc tính tế bào thấp hơn, so với PEI 25 kDa. Hoạt động phá vỡ màng thấp hơn của BPEA đã được xác nhận bằng thử nghiệm tan máu (Hình 10), thử nghiệm này cho thấy rằng BPEA gây ra mức độ giải phóng hemoglobin từ hồng cầu chuột thấp hơn nhiều so với PEI 25 kDa.
Đối với phân phối gen polymer, một trong những trở ngại cần vượt qua là màng tế bào,
