Vector là gì?
Trong lĩnh vực sinh học phân tử, vector đóng vai trò quan trọng như phương tiện vận chuyển và nhân bản DNA. Chúng là những phân tử DNA nhỏ, có khả năng chứa và sao chép các đoạn DNA mong muốn một cách độc lập bên trong tế bào chủ. Vector không chỉ tái bản mà còn tồn tại qua nhiều thế hệ mà không gây ảnh hưởng đến hệ gen của tế bào chủ. Dựa trên mục đích sử dụng, vector được chia thành hai loại chính: vector nhân bản và vector biểu hiện. Trong số các vector nhân bản phổ biến ở E. coli, plasmid, phage và cosmid là những đại diện tiêu biểu. Bài viết này sẽ đi sâu vào tìm hiểu về plasmid.
Định nghĩa Plasmid
Plasmid là những phân tử DNA nhỏ, thường có cấu trúc vòng khép kín và sợi đôi, tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể trong tế bào, chủ yếu là vi khuẩn. Điểm đặc biệt của plasmid là khả năng tự sao chép độc lập, nhờ vào các enzyme có sẵn trong tế bào vi khuẩn và không phụ thuộc vào quá trình sao chép nhiễm sắc thể chính.
Sơ đồ plasmid điển hình, hiển thị các gen kháng kháng sinh và vị trí khởi đầu sao chép
Plasmid có thể tồn tại với số lượng khác nhau trong tế bào vi khuẩn, tùy thuộc vào loại plasmid cụ thể. Một số plasmid chỉ có một bản sao duy nhất, tự tái bản một lần trong mỗi chu kỳ phân bào. Ngược lại, những plasmid khác có thể có nhiều bản sao, tái bản nhiều lần trong mỗi chu kỳ, với số lượng từ 10 đến 100 bản sao được coi là plasmid có số bản sao cao. Những plasmid chỉ có từ 1 đến 4 bản sao được xếp vào nhóm có số bản sao thấp.
Cấu trúc và Chức năng của Plasmid
Trong tế bào eukaryote, plasmid hiếm gặp hơn và chủ yếu được tìm thấy trong tế bào nấm men. Mỗi plasmid đều mang một chuỗi mã di truyền (sequence) quan trọng, đóng vai trò là điểm khởi đầu cho quá trình tự tái bản DNA. Vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này là yếu tố then chốt, cho phép DNA tự sao chép trong tế bào chủ. Nhờ khả năng tự tái bản này, plasmid trở thành vector chuyển gen lý tưởng để nhân dòng DNA mong muốn.
Do kích thước nhỏ gọn, plasmid thường chỉ chứa một số gen chọn lọc, trong đó đặc tính kháng kháng sinh là phổ biến nhất. Từ khi được phát hiện, plasmid đã trải qua nhiều cải tiến, bổ sung thêm các đặc tính quan trọng cho việc tạo dòng. Trong phòng thí nghiệm, các plasmid nhân tạo được tạo ra từ plasmid tự nhiên và được bổ sung thêm các chuỗi DNA chức năng.
Plasmid tái bản thường có các đặc điểm sau:
- Trọng lượng phân tử tương đối thấp, thường từ 3 đến 10 kb (kilobase).
- Có tính di truyền chọn lọc, giúp phân biệt các tế bào chứa plasmid.
- Có nhiều điểm cắt enzyme giới hạn, tạo thuận lợi cho việc chèn gen ngoại lai.
- Số lượng bản sao tương đối ổn định: plasmid chặt (stringent plasmid) có khoảng 1-5 bản sao/vi khuẩn, plasmid lỏng (relaxed plasmid) có khoảng 10-200 bản sao/vi khuẩn. Số lượng bản sao của plasmid ít có thể được tăng lên trong môi trường chứa chloramphenicol.
Ứng dụng của Plasmid trong Công nghệ Sinh học
Plasmid đóng vai trò then chốt trong nhiều lĩnh vực của công nghệ sinh học, bao gồm:
- Nhân bản gen: Plasmid được sử dụng rộng rãi để nhân bản các đoạn DNA mong muốn, tạo ra nhiều bản sao của gen cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Biểu hiện protein: Plasmid có thể được thiết kế để biểu hiện protein trong tế bào chủ, phục vụ cho việc sản xuất protein tái tổ hợp với mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng y học.
- Liệu pháp gen: Plasmid được sử dụng như vector để đưa gen vào tế bào bệnh nhân trong liệu pháp gen, mở ra tiềm năng điều trị các bệnh di truyền.
- Sản xuất vaccine: Plasmid có thể chứa các gen mã hóa kháng nguyên, được sử dụng để tạo ra vaccine DNA, kích thích hệ miễn dịch tạo ra phản ứng bảo vệ.
- Nghiên cứu khoa học: Plasmid là công cụ không thể thiếu trong các nghiên cứu về chức năng gen, tương tác protein-protein và nhiều lĩnh vực khác của sinh học phân tử.
Vector Biểu Hiện
Vector biểu hiện là một loại vector đặc biệt, được thiết kế để biểu hiện protein từ gen được chèn vào. Chúng được chia thành hai loại chính: vector biểu hiện nhân sơ (prokaryote) và vector biểu hiện nhân thực (eukaryote).
Đặc trưng cơ bản của vector biểu hiện nhân sơ: Hệ thống biểu hiện phổ biến nhất ở nhân sơ là E. coli. Vector biểu hiện nhân sơ, bên cạnh các đặc trưng cơ bản của plasmid, còn có các yếu tố đặc biệt khác liên quan đến quá trình biểu hiện protein. Ngoài promoter (nhân tố khởi động phiên mã) của vi khuẩn, một yếu tố quan trọng khác là vị trí kết hợp ribosome (ribosome binding site – RBS). Ở E. coli, RBS bao gồm codon khởi đầu (ATG) và trình tự DNA có độ dài 9-11 nucleotide nằm phía trên codon khởi đầu (trình tự Shine-Dalgarno – SD), có khả năng bổ sung với trình tự 3′ của 16S rRNA của E. coli. Sự hình thành cặp base giữa trình tự SD của mRNA và trình tự 3′ của 16S rRNA cho phép ribosome kết hợp với mRNA, sau đó dịch mã thành protein. Ngoài ra, cần có trình tự kết thúc phiên mã để đảm bảo quá trình phiên mã dừng lại đúng vị trí.
Đặc trưng cơ bản của vector biểu hiện nhân thực: Khác với vector biểu hiện nhân sơ, vector biểu hiện nhân thực thường mang gen neo, ví dụ như phosphotransferase (aph), có khả năng vô hiệu hóa G-418 hoặc puromycin, cho phép chọn lọc các tế bào đã nhận vector. Một số vector plasmid mang gen hy8, mã hóa hygromycin B phosphotransferase, giúp vô hiệu hóa hygromycin. Promoter của vector biểu hiện nhân thực được lựa chọn dựa trên loại tế bào nhân thực cụ thể. Enhancer và promoter từ trình tự lặp lại đầu cuối của virus Rous sarcoma (LTR) và virus tế bào lớn ở người (CMV) thường được sử dụng rộng rãi trong vector biểu hiện nhân thực. Ngoài ra, enhancer gen đầu của SV40 có hoạt tính trong nhiều tế bào động vật có vú, cũng được ứng dụng rộng rãi. Vector biểu hiện nhân thực cũng cần có tín hiệu kết thúc phiên mã và tín hiệu poly(A).