Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cây bông dễ bị ảnh hưởng bởi stress phi sinh học ở giai đoạn ba lá. Chúng tôi đã quan sát thấy các thay đổi hình thái khác nhau ở G. hirsutum Zhong 9807 trong giai đoạn ba lá dưới các nồng độ Na2CO3 khác nhau. Chúng tôi nhận thấy cây con có sự khác biệt rõ rệt giữa nhóm xử lý và nhóm đối chứng dưới stress 50 mM Na2CO3 sau 12 giờ. Để nghiên cứu các tác động so sánh của CO32−, Na+ và độ pH cao, hai phương pháp xử lý song song với nồng độ tương ứng là 100 mM đối với NaCl và 0,125 mM đối với NaOH đã được xem xét. Khả năng chịu mặn kiềm của Zhong 9807 đã được kiểm tra bằng cách so sánh stress muối (stress NaCl) với hai loại stress kiềm khác, stress NaOH và stress Na2CO3.
Sự thay đổi kiểu hình của ba phương pháp xử lý đã được thể hiện (Hình 1A, B). Lá héo và mất độ bóng nhẹ dưới stress NaCl, trong khi rễ không có thay đổi rõ rệt về kiểu hình, cho thấy rễ có thể có khả năng kháng cự mạnh hơn lá. Tuy nhiên, sự xỉn màu nhẹ ở lá và sự hóa đen đã được tìm thấy ở rễ dưới stress NaOH. Khi cây con chịu stress Na2CO3, rễ trở nên héo và đen nghiêm trọng, lá bị xỉn màu nặng và các đường gân gần như tối đi. Kết quả phân tích phương sai về hàm lượng diệp lục và hàm lượng nước tương đối (RWC) dưới stress Na2CO3 (Hình 1C, D) khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng, ngoại trừ RWC ở rễ.
Phân tích giải trình tự và căn chỉnh bộ phiên mã (Transcriptome)
Sử dụng loài tứ bội Gossypium hirsutum Zhong9807, các phân tích RNA-Seq đã được thực hiện trên ba lần lặp lại sinh học của mỗi mẫu. Các mẫu RNA của rễ và lá được thu thập sau 12 giờ gây stress muối và stress kiềm. Cây con được cấy vào điều kiện bình thường được sử dụng làm đối chứng. 24 thư viện đủ điều kiện đã được thiết lập. Các đoạn đọc thô ban đầu được xử lý để loại bỏ bộ điều hợp và các đoạn đọc chất lượng thấp. Các đoạn đọc sạch sau đó được ánh xạ vào bộ gen tham chiếu G. hirsutum bằng TopHat2. Khoảng 213,36 Gb đoạn đọc sạch đã được thu thập. Trung bình, 6,15 Gb đoạn đọc sạch đã được thu thập từ mỗi thư viện. Hơn 87,02% số đoạn đọc có điểm Q là Q30 và 78,23–83,44% tổng số đoạn đọc được căn chỉnh.
Các trình tự được căn chỉnh được lắp ráp bằng Cufflinks, được hướng dẫn bởi bộ gen chú thích của loài tứ bội G. hirsutum từ Cottongen. Các xét nghiệm RNA-Seq cho thấy có 60.369 unigene với 95,79% (57.825 unigene) gen được chú thích và 9,18% (5.544 unigene) gen mới. Để đánh giá độ tin cậy của DEG và lọc các mẫu bất thường, phân tích hệ số tương quan Pearson (PCC) đã được thực hiện. Phân tích tương quan chỉ ra rằng dưới cả ba stress mặn kiềm, rễ và lá cho thấy độ tương đồng hơn 85%, ngoại trừ các gen giữa RCK-1 và RCK-2 và LSS-1 và LSS-3.
Hồ sơ biểu hiện gen dưới stress NaOH gần như giống với tình trạng của nhóm đối chứng ở rễ. Tuy nhiên, hồ sơ biểu hiện gen dưới stress NaCl và Na2CO3 thì khác. Kết quả này chứng minh rằng thiệt hại do stress NaOH gây ra là ít nhất. Nó cũng cho thấy thiệt hại do stress Na2CO3 gây ra là nghiêm trọng nhất. Phân tích tương quan biểu hiện cho thấy kết quả tương tự ở lá và rễ.
Phân tích các gen biểu hiện khác biệt (DEGs) ở lá và rễ dưới các stress mặn kiềm khác nhau so với nhóm đối chứng
Mức độ biểu hiện gen được ước tính bằng các đoạn trên kilo base của transcript trên một triệu đoạn được ánh xạ (FPKM). Phân tích biểu hiện khác biệt của các phương pháp xử lý và nhóm đối chứng được thực hiện bằng DESeq. Ngưỡng của Fold Change ≥2 và FDR 2CO3: 20.492) và 6.564 DEG (NaCl: 452, NaOH: 50, Na2CO3: 6.458) đã thu được ở rễ và lá. Số lượng DEG dưới các stress khác nhau ở rễ và lá được trình bày là Na2CO3 > NaCl > NaOH, điều này cho thấy rằng stress Na2CO3 gây ra phản ứng sinh học đáng kể ở thực vật so với stress NaCl và stress NaOH. Để đáp ứng với stress mặn kiềm ở rễ và lá, phần lớn các gen bị điều chỉnh giảm ở rễ và được điều chỉnh tăng ở lá. Những kết quả này chỉ ra biểu hiện đặc hiệu cho mô của chúng để đáp ứng với stress.
Khoảng 8.800 (42,94%) tổng số DEG dưới stress Na2CO3 được tìm thấy là đặc hiệu cho rễ và 6.071 (94,00%) là DEG đặc hiệu cho lá. Hơn nữa, 4.056 (28,59%) tổng số DEG dưới stress NaCl là đặc hiệu cho rễ, trong khi 85 (18,8%) DEG là đặc hiệu cho lá. Hơn nữa, 930 (13,59%) tổng số DEG dưới stress NaOH là gen đặc hiệu cho rễ và 19 (38,00%) là DEG đặc hiệu cho lá. Dưới stress Na2CO3, 762 DEG thường được xác định ở rễ và lá. Để nghiên cứu hồ sơ biểu hiện của 762 gen này dưới các stress mặn kiềm khác nhau, FPKM của gen đã được chuẩn hóa và phân tích cụm K-means với FPKM được chuẩn hóa đã được sử dụng. Các gen này được chia thành tám cụm. Các gen trong mỗi cụm có cùng một hồ sơ biểu hiện. Cụm 4 là hồ sơ lớn nhất ở lá (167 gen, 21,91% trong số 762 gen), tiếp theo là cụm 3 (162 gen, 21,26%), cụm 1 (121 gen, 15,88%) và cụm 7 (117 gen, 15,35%).
Phân tích làm giàu GO (Gene Ontology) của các gen biểu hiện khác biệt
Để điều tra thêm chức năng của DEG, chúng tôi đã ánh xạ tất cả các DEG vào cơ sở dữ liệu GO. 5.769 (87,89%) và 20.508 (79,09%) DEG ở lá và rễ đã được chú thích. “Phản ứng với kích thích” (GO: 0050896) được làm giàu ở cả lá và rễ sau khi kết quả được phân loại. Các DEG được làm giàu khác nhau giữa các stress mặn kiềm, phù hợp với những thay đổi kiểu hình dưới các stress khác nhau. Theo thống kê, DEG dưới SS, AS và SAS xuất hiện như sau: Stress Na2CO3 > NaCl > NaOH. Các gen liên quan đến hấp thụ và phân vùng ion, chẳng hạn như SOS2, SOS3-Like, CCX, CDPK và các chất vận chuyển ABC, đã được phát hiện từ các gen này. Chúng được điều chỉnh tăng dưới stress Na2CO3 và NaCl, và được điều chỉnh giảm dưới stress NaOH.
Chú thích con đường trao đổi chất KEGG của sự trao đổi chất đường trong các phản ứng đối với các stress kiềm khác nhau
Phân tích chú thích của các con đường của Bách khoa toàn thư về Gen và Genomes Kyoto (KEGG) của DEG đã đóng góp vào việc giải mã các chức năng gen. Tổng cộng 1.392 (21,21%) và 5.510 (21,25%) DEG đã được chú thích ở rễ và lá. Các con đường làm giàu KEGG chỉ ra rằng các DEG cụ thể, được tìm thấy dưới ba stress mặn kiềm ở rễ và lá, đã được làm giàu rộng rãi trong các con đường truyền tín hiệu hormone thực vật, quang hợp, peroxidase và chuyển hóa glutathione. Theo các nghiên cứu trước đây, các con đường này có liên quan đến khả năng chịu đựng stress phi sinh học.
DEG đã được làm giàu đáng kể trong con đường “trao đổi chất tinh bột và sucrose” (ko00500) dưới stress NaOH và Na2CO3, nhưng không được làm giàu đáng kể dưới stress NaCl.
Phân tích và chú thích các yếu tố phiên mã
Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng các yếu tố phiên mã (TF) đóng một vai trò quan trọng trong khả năng chịu đựng stress. Chú thích yếu tố phiên mã đã được thực hiện trong số 762 DEG cụ thể. Các TF này được phân loại thành 18 họ và ba họ protein kinase. Ngoại trừ các họ bZIP (vùng cơ bản/khóa leucine), NAC (NAM/không có meristem đỉnh, ATAF/yếu tố hoạt hóa phiên mã Arabidopsis và CUC/lá mầm hình chén), MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) và ERF (các phần tử phản ứng ethylene) có liên quan đến khả năng chịu đựng mặn kiềm, họ yếu tố phiên mã C2H2 (Cys2/His2) cũng được làm giàu. C2H2, một protein ngón tay kẽm, có liên quan đến khả năng chịu đựng stress thẩm thấu của Arabidopsis thaliana.
