Nghiên cứu này tập trung vào tác động của các acid béo chuỗi ngắn (SCFAs), đặc biệt là Isobutyric Acid, lên sự sống của tế bào ung thư và tế bào T. Ban đầu, các nhà khoa học đã kiểm tra ảnh hưởng của bảy loại SCFAs (acetic, propionic, butyric, isobutyric, valeric, isovaleric và hexanoic acid) đối với sự sống của tế bào T hoặc tế bào ung thư. T3M-1 là một dòng tế bào từ ung thư biểu mô tế bào vảy của ung thư đầu và cổ ở người. Tế bào T được phân lập từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) của những người hiến tặng khỏe mạnh. Tất cả các SCFAs được thử nghiệm trong nghiên cứu này đều có tác dụng ức chế sự sống của tế bào T3M-1 phụ thuộc vào nồng độ sau 3 ngày nuôi cấy đơn (Hình 1a và Hình bổ sung S1). Tương tự, propionic, butyric, valeric, isovaleric và hexanoic acid làm giảm số lượng tế bào T trong nuôi cấy đơn một cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình bổ sung S1b–f).
Tuy nhiên, acetic và isobutyric acid có tác động tương đối nhỏ đến số lượng tế bào T, ngay cả ở nồng độ cao nhất (Hình 1a và Hình bổ sung S1a). Do đó, các nhà nghiên cứu đã chọn hai SCFAs này và tiếp tục kiểm tra ảnh hưởng của chúng đối với số lượng tế bào T và tế bào ung thư trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp (Hình 1a, Hình bổ sung S1a, S2). Acetic acid chỉ gây ra tác dụng ức chế chọn lọc đối với tế bào ung thư ở nồng độ 10 mM (Hình bổ sung S1a). Ngược lại, isobutyric acid ưu tiên ức chế sự sống của tế bào ung thư ở nồng độ 3 và 10 mM (Hình 1a).
Một số nghiên cứu đã điều tra ảnh hưởng của acetic acid, nhưng ít nghiên cứu đã xem xét chi tiết ảnh hưởng của isobutyric acid. Do đó, nghiên cứu tập trung vào isobutyric acid trong các thí nghiệm tiếp theo. Các nhà khoa học tiếp tục điều tra ảnh hưởng của isobutyric acid đối với sự sống của dòng tế bào ung thư ruột kết ở chuột CT-26 và tế bào T có nguồn gốc từ lách trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp. Cả tế bào T và tế bào ung thư đều giảm sau 3 ngày nuôi cấy hỗn hợp khi có isobutyric acid một cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 1b). Tuy nhiên, isobutyric acid ở nồng độ 10 mM làm giảm đáng kể số lượng tế bào CT-26 hơn 60%, trong khi hơn 60% tế bào T vẫn sống trong cùng điều kiện (Hình 1b). Điều đáng chú ý là không có sự ức chế tăng trưởng khi thêm hydrochloric acid (HCl) để tạo ra một môi trường acid tương tự như môi trường do isobutyric acid 10 mM gây ra, cho thấy rằng tác dụng này là do chính isobutyric acid, chứ không phải do pH thấp. Các nhà nghiên cứu tiếp tục phân tích ảnh hưởng của isobutyric acid đối với các dòng tế bào ung thư ruột kết ở người và chuột khác trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp. Dòng tế bào ung thư ruột kết ở người SW480 sống sót ở nồng độ isobutyric acid 3 mM (Hình S2b), trái ngược với kết quả thu được với T3M-1, vốn nhạy cảm với isobutyric acid ở cùng nồng độ (Hình 1a). Điều này cho thấy một số dòng tế bào ung thư tương đối kháng với isobutyric acid. Một dòng tế bào ung thư ruột kết khác ở chuột MC38 giảm đáng kể về số lượng với isobutyric acid 10 mM (Hình S2c), tương tự như kết quả với CT-26. Cùng với kết quả thu được với các dòng tế bào ở người và chuột khác, những kết quả này cho thấy rằng isobutyric acid ưu tiên ức chế sự sống của tế bào ung thư so với tế bào T.
Ảnh hưởng của Isobutyric Acid đến Kiểu Hình Miễn Dịch của Tế Bào T
Để mô tả đặc điểm kiểu hình của tế bào T khi điều trị bằng isobutyric acid, các nhà khoa học đã thực hiện phân tích tế bào dòng chảy đối với tế bào T trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp. Ở người, cả quần thể tế bào CD4 và CD8 T đều giảm ở nồng độ isobutyric acid 10 mM. Tuy nhiên, tác dụng ức chế của isobutyric acid đối với tế bào Treg (CD4 + CD25 + CD127- FoxP3 +) mạnh hơn so với tế bào CD4 hoặc CD8 T (Hình 2a). Điều này đã được xác nhận bởi thí nghiệm nuôi cấy hỗn hợp với một dòng tế bào khác SW480 (Hình S3b). So với tế bào T ở người, tế bào CD4 và CD8 T ở chuột tương đối kháng, ngay cả ở nồng độ cao của isobutyric acid (Hình 2a). Ngược lại, isobutyric acid có tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ đối với tế bào Treg ở chuột (Hình 2a). Những kết quả này phần nào được tái tạo bằng cách nuôi cấy hỗn hợp sử dụng một dòng tế bào ung thư ruột kết khác MC38 (Hình S4b), cho thấy rằng isobutyric acid có tác dụng ức chế ưu tiên đối với tế bào Treg so với các quần thể tế bào T khác.
Tiếp theo, các nhà khoa học đã phân tích sự biểu hiện của một số dấu ấn hoạt hóa trên mỗi quần thể tế bào T. Sự biểu hiện PD-1 tăng lên đáng kể bởi isobutyric acid một cách phụ thuộc vào nồng độ trong tế bào T ở người (Hình 2b, S3c). Ở chuột, sự biểu hiện PD-1 trong tế bào CD4 + và CD8 + T tăng lên khi nuôi cấy hỗn hợp với CT-26 một cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 2b). Tuy nhiên, tác dụng này không nổi bật ở những tế bào được nuôi cấy hỗn hợp với tế bào MC38 (Hình S4c). Sự biểu hiện PD-1 trong tế bào T điều hòa không tăng lên khi đáp ứng với isobutyric acid và thay vào đó giảm xuống khi nuôi cấy hỗn hợp với tế bào MC38 (Hình 2b và S4c). Tiếp theo, các nhà nghiên cứu đã đo HLA-DR như một dấu ấn hoạt hóa cho tế bào T ở người. Isobutyric acid làm tăng đáng kể sự biểu hiện HLA-DR trong tế bào CD4 +, CD8 + T và tế bào Treg ở người một cách phụ thuộc vào nồng độ (Hình 2c và S3d). Sự biểu hiện của một dấu ấn hoạt hóa khác cho tế bào T CD95 không bị thay đổi trong tế bào T ở người bởi isobutyric acid, ngoại trừ sự giảm tinh tế của tế bào CD8 + T ở nồng độ 10 mM khi nuôi cấy hỗn hợp với SW480 (Hình S3e). Tuy nhiên, trong tế bào T ở chuột, isobutyric acid làm tăng sự biểu hiện của CD95 trong một số quần thể tế bào T (Hình S4d). Hơn nữa, chất đồng kích thích tế bào T có thể gây ra (ICOS) được điều hòa tăng bởi điều trị isobutyric acid 10 mM đặc biệt ở cả tế bào CD4 + và CD8 + T ở người (Hình 2d). Những thay đổi trên các dấu ấn hoạt hóa này không bị gây ra bởi điều trị hydrochloric acid, cho thấy rằng những tác dụng này là do chính isobutyric acid. Sự biểu hiện của CTLA-4, Ki67 và Tim3 ở người, cũng như CTLA-4, CD69 và ICOS ở chuột, không bị thay đổi bởi điều trị bằng isobutyric acid (Hình S5). Nhìn chung, những kết quả này cho thấy rằng isobutyric acid kích hoạt tế bào T trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp.
Ảnh Hưởng Trực Tiếp của Isobutyric Acid Đến Sự Biểu Hiện Gen của Tế Bào T
Để điều tra các cơ chế cơ bản về những thay đổi trong quần thể tế bào T trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp, các nhà khoa học đã xử lý tế bào T nuôi cấy đơn với các nồng độ khác nhau của isobutyric acid và định lượng sự biểu hiện mRNA của một số gen bằng cách sử dụng phản ứng chuỗi polymerase định lượng (qPCR). Ở cả tế bào T có nguồn gốc từ PBMC ở người và tế bào T có nguồn gốc từ lách ở chuột, isobutyric acid làm giảm đáng kể sự biểu hiện mRNA FOXP3 (Hình 3), phù hợp với sự giảm số lượng tế bào T dương tính với FOXP3 trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp (Hình 2a). Sự biểu hiện mRNA INFG tăng lên đáng kể một cách phụ thuộc vào nồng độ ở cả tế bào T ở người và chuột (Hình 3). Sự biểu hiện mRNA PDCD1 được điều hòa tăng đáng kể bởi isobutyric acid trong tế bào T ở người (Hình 3a). Tương tự, sự điều hòa tăng PDCD1 phụ thuộc vào nồng độ đã được quan sát thấy trong tế bào T ở chuột, mặc dù sự khác biệt không đáng kể. ICOS mRNA chỉ được điều hòa tăng trong tế bào T ở người ở nồng độ cao hơn của isobutyric acid, mặc dù sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Hình 3a). Sự biểu hiện ICOS trong tế bào T ở chuột tăng nhẹ khi điều trị bằng isobutyric acid 10 mM (Hình 3b). Hơn nữa, kết quả qPCR thu được với tế bào T nuôi cấy đơn phần lớn phù hợp với kết quả phân tích tế bào dòng chảy trong môi trường nuôi cấy hỗn hợp, làm nổi bật tác dụng trực tiếp của isobutyric acid đối với tế bào T.
Tác Dụng Chống Ung Thư In Vivo của Isobutyric Acid
Vì isobutyric acid điều hòa tăng sự biểu hiện PD-1 trong tế bào T, các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết rằng sự kết hợp của kháng thể chống PD-1 và isobutyric acid có tác dụng chống khối u hiệp đồng trong mô hình chuột in vivo (Hình 4a). Ở đây, chuột BALB/C đực 8–12 tuần tuổi được điều trị trước bằng isobutyric acid 100 mM hoặc nước phù hợp với pH bằng đường uống, và 2 × 105 tế bào/50 μL tế bào ung thư ruột kết CT26 được tiêm dưới da sau 2 tuần. Các nhà nghiên cứu đã quyết định nồng độ isobutyric acid để cho chuột ăn theo một nghiên cứu trước đó, trong đó chuột nhận nước uống có chứa butyric acid 100 mM. Mặc dù chuột được điều trị bằng isobutyric acid uống ít nước hơn một chút so với chuột được điều trị bằng nước phù hợp với pH (5,7 mL mỗi con chuột một ngày trong nhóm đối chứng so với 4,3 mL trong nhóm isobutyric acid), nhưng lượng nước uống của mỗi nhóm nằm trong phạm vi bình thường. Kháng thể chống PD-1 hoặc IgG (150 μg/150 μL) được tiêm trong phúc mạc vào các ngày 4, 11, 18 và 25 sau khi tiêm tế bào ung thư, và các khối u được loại bỏ sau 28 ngày. Mặc dù không đáng kể, cả đơn trị liệu bằng anti-PD-1 và đơn trị liệu bằng isobutyric acid đều làm giảm thể tích khối u (Hình 4b,c). Điều thú vị là liệu pháp kết hợp với kháng thể chống PD-1 và isobutyric acid ức chế đáng kể sự phát triển của khối u (p = 0,0144) (Hình 4b–e). Như đã báo cáo trước đây, liệu pháp anti-PD-1 cho thấy các phản ứng phân đôi chia chuột thành nhóm đáp ứng và nhóm không đáp ứng (Hình 4c,d). Tỷ lệ đáp ứng tổng thể (tỷ lệ đáp ứng hoàn toàn cộng với tỷ lệ đáp ứng một phần) của liệu pháp kết hợp với kháng thể chống PD-1 và isobutyric acid cao hơn một chút so với đơn trị liệu bằng anti-PD-1 (Hình 4e). Sự phát triển khối u riêng lẻ của chuột không đáp ứng được điều trị bằng isobutyric acid cộng với kháng thể chống PD-1 nhỏ hơn đáng kể so với chỉ dùng kháng thể chống PD-1 (Hình 4c). Những kết quả này chỉ ra rằng isobutyric acid tăng cường tác dụng chống khối u của kháng thể chống PD-1. Nhuộm hóa mô miễn dịch của các mô ung thư cho thấy thêm rằng số lượng tế bào CD3 + T xâm nhập khối u tăng lên đáng kể với liệu pháp kết hợp kháng thể chống PD-1 và isobutyric acid (Hình 4f,g). Ngoài ra, sự biểu hiện gen của IFNG, ICOS và PDCD1 tăng lên đáng kể trong mô khối u khi điều trị kết hợp (Hình 4h). Một dấu ấn hoạt hóa CD95 cũng tăng lên do đơn trị liệu bằng isobutyric acid. Không có sự khác biệt đáng kể trong sự biểu hiện mRNA của CTLA-4 (Hình 4h).
Các nhà khoa học cũng đã kiểm tra xem các cytokine ức chế miễn dịch như IL-10 hoặc TGF beta có vai trò nào trong việc tăng cường tác dụng chống khối u bằng cách kết hợp kháng thể chống PD-1 cộng với isobutyric acid hay không. Sự biểu hiện của các cytokine này không bị ảnh hưởng bởi kháng thể chống PD-1 và/hoặc isobutyric acid (Hình S6), cho thấy rằng các cytokine này không liên quan về mặt cơ học. Hơn nữa, isobutyric acid không làm tăng sự biểu hiện trên bề mặt của PD-L1 hoặc các phân tử MHC lớp I trên tế bào khối u về tỷ lệ phần trăm và cường độ huỳnh quang trung bình (Hình S7), cho thấy rằng tác dụng tăng cường của isobutyric acid không phải do sự biểu hiện của phối tử điểm kiểm soát miễn dịch hoặc sự trình diện kháng nguyên trên tế bào khối u. Những kết quả này cho thấy rằng isobutyric acid có thể tăng cường hiệu quả liệu pháp miễn dịch anti-PD-1 một cách hiệu quả thông qua tác dụng chống ung thư trực tiếp đối với tế bào ung thư và thông qua sự kích hoạt tế bào T (Hình 5).
