Prostaglandin I2 (PGI2), hay còn gọi là Hi Ra I2, là một prostanoid mạch máu quan trọng, đóng vai trò cân bằng trong quá trình sinh mạch của khối u. Honn và cộng sự là những người đầu tiên chứng minh PGI2 làm giảm đáng kể số lượng di căn khối u phổi. Từ đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm hiểu sâu hơn về tác dụng chống di căn của PGI2 và các chất tương tự của nó trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa tín hiệu PGI2-thụ thể prostacyclin (IP) và sự sinh mạch của khối u, đặc biệt là sự tương tác giữa tế bào nội mô và pericyte, vẫn chưa được làm rõ.
Mạch máu khối u thường có cấu trúc và chức năng bất thường, thiếu sự sắp xếp thứ bậc thông thường của tiểu động mạch, mao mạch và tĩnh mạch. Tế bào nội mô khối u thường liên kết lỏng lẻo với nhau và được bao phủ bởi ít pericyte hơn, đồng thời các pericyte này cũng bất thường hơn. Dữ liệu lâm sàng cho thấy, việc bao phủ pericyte thấp trên mạch máu khối u có liên quan đến tiên lượng xấu của bệnh nhân, và rối loạn chức năng pericyte có thể làm tăng di căn.
Các nghiên cứu gần đây đã tiết lộ những tác động mới của PGI2 lên các tế bào đích của nó, chẳng hạn như tế bào nội mô và tế bào tiền thân nội mô, cho thấy rằng tín hiệu PGI2-IP làm suy yếu sự trưởng thành mạch máu thông qua sự tương tác giữa tế bào nội mô và pericyte. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá xem liệu việc kích hoạt tín hiệu PGI2-IP của mạch máu khối u bằng một chất tương tự PGI2 ổn định, beraprost sodium (BPS), có tăng cường sự kết dính của pericyte vào tế bào nội mô, gây ra sự trưởng thành của mạch máu khối u, giảm các vùng thiếu oxy trong các khối u di căn và dẫn đến ức chế di căn phổi trong ung thư phổi hay không.
Vật liệu và phương pháp
Dưới đây là tóm tắt các vật liệu và phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của Hi ra I2 (BPS) lên di căn ung thư phổi ở chuột.
Dòng tế bào ung thư phổi và thuốc thử
Dòng tế bào ung thư biểu mô phổi Lewis (LLC), có nguồn gốc từ chuột C57BL/6, được mua từ American Type Culture Collection (ATCC). Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640, bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (FBS) và các chất bổ sung khác. Beraprost sodium (BPS) được cung cấp bởi Toray Industries, Inc.
Mô hình di căn phổi ở chuột
Chuột cái C57BL/6 (8-10 tuần tuổi) được tiêm tế bào LLC (5.0×106 tế bào) vào tĩnh mạch đuôi để tạo ra di căn khối u phổi. Một bơm thẩm thấu mini Alzet chứa BPS (20 μg/ml) hoặc nước cất khử ion (DDW) được cấy dưới da của mỗi con chuột để truyền liên tục trong 3 tuần. Để đánh giá vùng thiếu oxy, chuột được cho uống Hypoxyprobe-1 trước khi hi sinh.
Hóa mô miễn dịch
Các dấu ấn pericyte α-SMA và NG2, cùng với dấu ấn tế bào nội mô Endomucin, được nghiên cứu bằng phương pháp huỳnh quang miễn dịch để đánh giá sự sinh mạch trong các khối u phổi di căn. Các vùng thiếu oxy được đánh giá bằng bộ kit Hypoxyprobe-1. Các mẫu phổi được cố định bằng kẽm, cắt lớp và xử lý để loại bỏ paraffin. Các lát cắt được ủ với kháng thể đặc hiệu và sau đó được ủ với kháng thể thứ cấp liên kết với chất huỳnh quang.
Định lượng di căn phổi
Phổi chuột được cố định và nhúng paraffin. Di căn khối u được đánh giá bằng nhuộm hematoxylin và eosin (H&E). Số lượng nốt di căn được đếm và diện tích di căn được định lượng bằng phần mềm ImageJ.
DDW và BPS được xử lý bằng phần mềm ImageJ với cùng một ngưỡng. Các khối u được chọn ngẫu nhiên và diện tích khối u, số lượng tế bào Endomucin+ và số lượng tế bào α-SMA+ (hoặc NG2+)/Endomucin+ dương tính kép được định lượng. Kết quả được báo cáo là số lượng pericyte liên kết với mạch máu trên mỗi tế bào Endomucin+ trên mỗi diện tích khối u (/mm2).
Kính hiển vi điện tử quét
Các mẫu phổi được cố định bằng glutaraldehyde và paraformaldehyde, sau đó được xử lý bằng dung dịch KOH để loại bỏ chất nền ngoại bào xung quanh mạch máu khối u. Các mẫu sau đó được nhuộm dẫn điện bằng axit tannic và OsO4, khử nước và làm khô tới điểm tới hạn. Cuối cùng, các mẫu được phủ platinum-palladium và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường.
Thử nghiệm tăng trưởng Clonogenic
Các tế bào LLC (1.5×103 tế bào) được ủ trong đĩa 6 giếng trong 24 giờ. Sau đó, môi trường tăng trưởng được thay đổi thành môi trường hoàn chỉnh có chứa nồng độ BPS được chỉ định. Các tế bào được xử lý được ủ trong điều kiện normoxic trong 10 ngày. Sau khi ủ, các khuẩn lạc trong đĩa 6 giếng được nhuộm bằng tinh thể tím 0,5%. Số lượng khuẩn lạc được xác định bằng bộ đếm khuẩn lạc và phần mềm.
Xét nghiệm tăng sinh tế bào
Chúng tôi đã sử dụng xét nghiệm BrdU để đánh giá sự tăng sinh tế bào. Các tế bào LLC (3.0×103 tế bào) được ủ trong đĩa 96 giếng. Ngày hôm sau, môi trường được thay thế bằng môi trường hoàn chỉnh có chứa nồng độ BPS được chỉ định và các tế bào LLC được ủ trong 3 ngày. Sau 3 ngày điều trị bằng BPS, xét nghiệm BrdU được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. BrdU được thêm vào môi trường và các tế bào LLC được ủ trong 2 giờ. Sự hấp thụ BrdU trong các tế bào được xử lý được đánh giá bằng máy đo độ sáng trên vi tấm.
Mảng kháng thể
Các tế bào LLC (2.5×103 tế bào) được ủ trong đĩa 100 mm trong 24 giờ. Sau đó, môi trường tăng trưởng được thay đổi thành môi trường hoàn chỉnh có chứa 0 hoặc 10 nM BPS. Các tế bào được xử lý được ủ trong điều kiện normoxic trong 4 ngày. Sau khi ủ, chúng tôi đã đo phổ cytokine trong dịch nổi bằng bộ kit Proteome Profiler™ Mouse Angiogenesis Array, bộ kit này phát hiện đồng thời 53 cytokine, chemokine và yếu tố tăng trưởng. Màng mảng được xử lý theo khuyến nghị của nhà sản xuất. Cường độ tín hiệu được đo trên máy dò độ phát quang LAS-3000 và các hình ảnh thu được được phân tích bằng Multi Gauge (Phiên bản 2.2; cả hai đều từ Fujifilm, Tokyo, Nhật Bản). Để so sánh cường độ phát quang của các mẫu, chúng tôi đã trừ đi vết nhuộm nền và chuẩn hóa dữ liệu theo các đối chứng dương trên cùng một màng.
Phân tích thống kê
Các phép đo được trình bày dưới dạng phương tiện ± SEM. Kết quả được phân tích bằng phép kiểm tra t của Student bằng Microsoft Excel. p hai mặt
Kết quả
Dưới đây là các kết quả chính thu được từ nghiên cứu về ảnh hưởng của Hi ra I2 (BPS) đối với di căn ung thư phổi ở chuột.
Điều trị BPS làm giảm di căn phổi
Để đánh giá ảnh hưởng của BPS đối với di căn phổi, chúng tôi đã sử dụng mô hình di căn phổi thực nghiệm. Sau khi tiêm tế bào khối u, chuột được điều trị bằng BPS trong 3 tuần; sau đó chúng được hi sinh và di căn phổi được đếm trong các phần phổi nhuộm H&E. Ở các nhóm đối chứng, các khối u với sự lan rộng màng phổi rộng rãi của các di căn đã thuộc địa được quan sát thấy, trong khi các khối u với các nốt di căn nhỏ được nhóm ngẫu nhiên được quan sát thấy ở nhóm được điều trị bằng BPS (Hình 1A). Số lượng nốt di căn trung bình ở nhóm được điều trị bằng BPS giảm đáng kể so với nhóm đối chứng (lần lượt là 13,8 so với 21,0, pHình 1B). Diện tích nốt di căn trung bình ở nhóm được điều trị bằng BPS nhỏ hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (lần lượt là 0,06 và 0,18/mm2, pHình 1B). Những kết quả này cho thấy rằng việc dùng BPS làm giảm đáng kể số lượng di căn phổi trong mô hình di căn phổi ở chuột của chúng tôi.
BPS tăng cường sự tương tác giữa pericyte và nội mô trong vi mạch khối u
Tiếp theo, để đánh giá sự trưởng thành mạch máu thông qua sự tương tác giữa tế bào nội mô và pericyte, chúng tôi đã phân tích cấu trúc của mạch máu khối u trong các khối u di căn ở chuột bằng kính hiển vi điện tử quét. Ở nhóm được điều trị bằng BPS, các cơ thể pericyte (màu xanh lá cây) gắn vào các ống mao mạch nội mô (màu đỏ) cùng với các quá trình và đường kính của mạch máu khối u giảm, trong khi ở nhóm đối chứng, pericyte vắng mặt hoặc được kết nối lỏng lẻu (Hình 2A).
Để đánh giá ảnh hưởng của BPS đối với sự sinh mạch của khối u, bao gồm cả sự kết hợp của pericyte tại vị trí di căn, các pericyte (tế bào α-SMA+ hoặc NG2+) và tế bào nội mô (tế bào Endomucin+) tại vị trí khối u di căn đã được phân tích bằng huỳnh quang miễn dịch (Hình 2B và 3A). Trong nhóm đối chứng, các tế bào α-SMA+ hoặc NG2+ chủ yếu nằm ngẫu nhiên trong các vị trí khối u di căn và chúng không định vị cùng với các tế bào Endomucin+ (Hình 2B và 3A), trong khi ở nhóm được điều trị bằng BPS, các tế bào α-SMA+ hoặc NG2+ cùng tồn tại thường xuyên bên cạnh các tế bào Endomucin+ và hầu hết các tế bào này được hợp nhất với các tế bào Endomucin+ (Hình 2B và 3A), điều này cho thấy rằng số lượng pericyte trưởng thành đã tăng lên, và hơn nữa, số lượng pericyte gắn vào nội mô đã tăng lên so với nhóm đối chứng (Hình 2C và 3B). Những kết quả này cho thấy rằng BPS tăng cường mạnh mẽ sự tương tác giữa pericyte và nội mô trong vi mạch khối u.
BPS gây ra sự trưởng thành chức năng mạch máu trong các khối u di căn
Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng hệ mạch có chức năng trưởng thành mà không có các vùng thiếu oxy sẽ loại bỏ di căn khối u vì các tế bào nội mô được bao phủ bởi pericyte được coi là ‘hệ mạch trưởng thành’, hiếm khi được quan sát thấy trong vùng khối u. Để đánh giá sự trưởng thành của mạch máu khối u, chúng tôi đã đo mức độ thiếu oxy trong các khối u di căn bằng hóa mô miễn dịch bằng pimonidazole làm dấu ấn thiếu oxy. Pimonidazole nhuộm bên trong các khối u di căn ở nhóm đối chứng rộng rãi, trong khi nó nhuộm các vùng rải rác và giảm ở nhóm được điều trị bằng BPS (Hình 4A). Nhuộm pimonidazole trên mỗi diện tích khối u ở nhóm được điều trị bằng BPS là 0,5%, trong khi ở nhóm đối chứng là 1,9%. Diện tích nhuộm bởi pimonidazole giảm đáng kể ở nhóm được điều trị bằng BPS (pHình 4B). Những kết quả này cho thấy rằng BPS gây ra sự trưởng thành của chức năng mạch máu trong các khối u di căn.
Tác dụng chống khối u của BPS đối với tế bào ung thư
Vì tác dụng ức chế trực tiếp của chất tương tự PGI2 đối với tế bào khối u đã được báo cáo, chúng tôi đã đánh giá tác dụng chống khối u của BPS đối với tế bào LLC. Sự phát triển của tế bào được đánh giá bằng xét nghiệm tăng trưởng tế bào BrdU hoặc xét nghiệm clonogenic (Hình 5A và B). Trong kết quả của chúng tôi, BPS không ức chế sự phát triển của khối u. Để kiểm tra các yếu tố tự tiết liên quan đến sự sinh mạch của khối u, chúng tôi đã phân tích ảnh hưởng của môi trường có điều kiện có hoặc không có BPS đối với tế bào LLC bằng mảng kháng thể, đồng thời phát hiện nồng độ tương đối của 53 protein liên quan đến sự sinh mạch (Hình 5C). Trong xét nghiệm này, osteopontin, serpin E1 và MCP-1 đã tăng lên ở cả nhóm được điều trị bằng BPS và nhóm không được điều trị, nhưng sự thay đổi của các yếu tố này không đáng kể. Dựa trên những kết quả này, BPS không ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của tế bào LLC.
Thảo luận
Trong nghiên cứu này, số lượng di căn phổi đã giảm đáng kể khi điều trị bằng BPS trong mô hình chuột của chúng tôi. Kể từ báo cáo đầu tiên từ Honn và các đồng nghiệp chứng minh rằng PGI2 và các chất tương tự của nó làm giảm mạnh số lượng di căn phổi, các nghiên cứu về ảnh hưởng của PGI2 đối với di căn đã được lặp lại bằng cách sử dụng nhiều dòng tế bào khối u khác nhau. Vì các quá trình đa bước hình thành di căn chịu trách nhiệm cho sự lan rộng của khối u, nên cần phân tích ảnh hưởng của BPS đối với khối u và vi môi trường khối u. Hầu hết các nghiên cứu đã kiểm tra: i) sự kết tập tiểu cầu do tế bào khối u gây ra và sự ức chế của nó bởi PGI2; ii) ngăn ngừa sự co rút của tế bào nội mô; iii) điều chỉnh hệ thống miễn dịch; hoặc iii) tác dụng ức chế trực tiếp đối với tế bào khối u. Tuy nhiên, các cơ chế trưởng thành mạch máu khối u bởi PGI2 trước đây chưa được kiểm tra.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng BPS tăng cường mạnh mẽ sự tương tác giữa pericyte và nội mô trong vi mạch khối u, đây là một cơ chế chống di căn mới của chất tương tự PGI2. Các kết quả hiện tại cho thấy rằng BPS gây ra những thay đổi cấu trúc trong mạch máu khối u và dẫn đến sự trưởng thành của nội mô, điều này phù hợp với kết quả trước đây của chúng tôi. Do đó, sự trưởng thành của mạch máu khối u đã được gây ra và mức độ thiếu oxy trong các khối u di căn giảm, dẫn đến sự bình thường hóa mạch máu do BPS gây ra trong vi môi trường khối u. Những kết quả này có vẻ nghịch lý vì việc cải thiện tuần hoàn trong khối u dẫn đến sự co rút khối u, nhưng các liệu pháp chống sinh mạch được sử dụng trên lâm sàng nhắm mục tiêu thành công vào mạch máu khối u được cho là làm tăng sự co rút khối u do vi môi trường gây ra. Bevacizumab, một loại thuốc chống sinh mạch, hiện đang được sử dụng kết hợp với tác nhân gây độc tế bào để bình thường hóa mạch máu.
Trong phân tích hóa mô miễn dịch, các tế bào α-SMA+ hợp nhất với các tế bào Endomucin+ đã tăng lên đáng kể ở nhóm được điều trị bằng BPS (Hình 2C), trong khi các tế bào NG2+ hợp nhất với các tế bào Endomucin+ đã không tăng lên đáng kể ở nhóm được điều trị bằng BPS (Hình 3B). Kết quả này dường như không nhất quán. Tuy nhiên, nói chung, người ta biết rằng α-SMA biểu hiện ở trạng thái trưởng thành hơn của pericyte so với NG2 và BPS đã gây ra nhiều pericyte trưởng thành hơn trong nghiên cứu này. Số lượng tế bào nội mô trong các khối u tăng lên ở nhóm được điều trị bằng BPS có hoặc không có pericyte (dữ liệu không được hiển thị). Những kết quả này chỉ ra rằng BPS thúc đẩy sự trưởng thành của mạch máu khối u.
Cuối cùng, để loại trừ khả năng ảnh hưởng trực tiếp của khối u của BPS đối với tế bào LLC, chúng tôi đã nghiên cứu sự ức chế tăng trưởng khối u bằng cách điều trị các tế bào nuôi cấy bằng BPS ở nồng độ lên đến 1 μM. Các yếu tố sinh mạch do chính tế bào LLC tạo ra không thay đổi. Những kết quả này cho thấy rằng BPS không ảnh hưởng trực tiếp đến khối u, mà ảnh hưởng đến vi môi trường khối u.
Việc thay đổi vi môi trường khối u bằng cách bổ sung các chất tương tự PGI2 ảnh hưởng đến sự tương tác giữa nội mô và pericyte có thể mang lại các chiến lược cho các liệu pháp sinh mạch nhắm mục tiêu. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu lâm sàng bổ sung để làm rõ những lợi ích và rủi ro tiềm ẩn liên quan đến điều trị chống di căn bằng các chất tương tự PGI2.
